Paulino Gómez-Puertas (CAB) 

Cuando una secuencia de estructura desconocida tiene un homologo claro de estructura conocida se puede modelar basandose en esta estructura. Si la homología es alta y el alineamiento es bueno, las regiones con estructura secundaria (core de la proteina) no suelen tener problemas a la hora de modelarse, para ellas se toman las coordenadas del esqueleto y los Cb de la estructura molde. Para las regiones loop se usan distintas aproximaciones dependiendo del programa. Para las cadenas laterales se usan librerias de rotámeros y dinámica molecular o minimización de energía.

• SWISS-MODEL.

[Acceso]
Hay muchos programas que hacen modelado por homología pero suelen ser complejos de usar y suelen requerir conocimiento experto humano. SWISS-MODEL tiene un interface WWW que lo hace muy sencillo de usar, es totalmente automático y su fiabilidad es comparable a los otros programas mas complejos. Ademas realiza todo el proceso, desde la búsqueda de proteinas cristalizadas homólogas hasta la generación del modelo 3D final.
La opcion de "modelo aproximado" comprueba si hay una estructura lo suficientemente homóloga para poder hacer el modelado, si existe, genera un primer modelo y datos que son necesarios para hacer luego el modelo refinado.

Evaluación de modelos.

• Biotech suite.

Servidor que evlua la calidad de una estructura usando 3 programas diferentes y luego combina los resultados.
[Información][Enviar input]
 
 
• Solv_Pref.

Programa de L. Holm y C. Sander que calcula la exposición al solvente de los residuos del modelo y la compara con preferencias de solvatación por residuo extraidas de bases de datos.
El programa se ejecuta localmente entrando:

solv_pref

Resultado: En general cualquier valor negativo de la energía de solvatación es indicativo de estructura estable. Otra buena medida es la relación entre la energía de solvatación y el numero de átomos: si este valor es <= -0.1 se puede considerar un buen modelo.
 
 
• ProSA. (M. Sippl)

Programa basado en potenciales extraidos de bases de datos. Evalua cual es la energía del modelo tridimensional basada en estos potenciales. Se espera que los modelos malos tengan energías mas altas que los buenos.

Introducimos la sequencia problema.

>secuencia-problema

MSKVPRNFRL LEELEKGEKG FGPESCSYGL ADSDDITMTK WNGTILGPPH SNHENRIYSL
SIDCGPNYPD SPPKVTFISK INLPCVNPTT GEVQTDFHTL RDWKRAYTME TLLLDLRKEM
ATPANKKLRQ PKEGETF

Una vez que tenemos la secuencia que queremos analizar, debemos introducirla en el programa SWISS-MODEL a través de su servidor web, accesible en la red. En este servidor debemos introducir además de la secuencia, nuesta dirección de "mail", nuestro nombre, y un título para el proceso SWISS-MODEL (First Approach mode).
 
 
 

Recepción en nuestro mail de un mensaje confirmatorio.

Recepción de un mail con los distintos procesos seguidos por SWISS-MODEL.

1. SWISS-MODEL realiza una búsqueda por homología de secuencia en una base de datos de secuencias de estructura conocidas, el programa utilizado es "BLASTP2" y la base de datos consultada "ExNRL-3D". Los resultados se muestran ordenados por la puntuación P(N) del BLAST:

     AlignMaster output
     ============================================================
     
     Length of target sequence: 137 residues
     
     Searching sequences of known 3D structures
     Found 12UCE.pdb with P(N)=5.0e-12
     Found 11AYZ.pdb with P(N)=1.2e-08
     Found 11AAK.pdb with P(N)=5.3e-08
     Found 12AAK.pdb with P(N)=5.3e-08
     Found 11UCZ.pdb with P(N)=1.1e-07
     Found 12UCZ.pdb with P(N)=1.1e-07
     Found 11A3S.pdb with P(N)=1.0e-05

2. Con el programa "SIM" Se seleccionan todos los "moldes" (estructuras 3D sobre las que nos basaremos para hacer nuestro modelo) con una identidad de secuencia superior al 25% y con una región alineada superior a 20 residuos. Adicionalmente, este programa detecta los posibles distintos dominios que debieran ser modelados a partir de moldes estructurales diferentes. Este proceso queda recogido del siguiente modo...

     Extracting template sequences
     
     Running pair-wise alignments with target sequence
     Sequence identity of templates with target:
     
     12UCE.pdb: 22.85 % identity
     11AYZ.pdb: 27.8 % identity
     11AAK.pdb: 17.15 % identity
     12AAK.pdb: 17.15 % identity
     11UCZ.pdb: 29.6 % identity
     12UCZ.pdb: 29.6 % identity
     11A3S.pdb: 22.5 % identity
     
     Looking for template groups
     Global alignment overview:
     
     Taget Sequence: |====================================================================|
     12UCE.pdb       |                  -------------------------------------------------
     11AYZ.pdb       |                    ------------------------------------------------
     11AAK.pdb       |               -----------------------------------------------------
     12AAK.pdb       |               -----------------------------------------------------
     11UCZ.pdb       |                 --------------------------                        
     12UCZ.pdb       |                 --------------------------                        
     11A3S.pdb       |                 --------------------------------------------------
     
     AlignMaster found 1 regions to model separately:
             1: Using template(s)   11A3S.pdb 11AAK.pdb 11AYZ.pdb 11UCZ.pdb 12AAK.pdb 12UCE.pdb 12UCZ.pdb
     
     12UCE.pdb has been rejected,  too low similarity with Target sequence (22.85 % identity.)
     11AAK.pdb has been rejected,  too low similarity with Target sequence (17.15 % identity.)
     12AAK.pdb has been rejected,  too low similarity with Target sequence (17.15 % identity.)
     11A3S.pdb has been rejected,  too low similarity with Target sequence (22.5 % identity.)

3. En este paso se genera el fichero de entrada ("imput file") para el program "ProModII" el cual basándose en los moldes seleccionados (templates) de la base de datos "ExPDB" originará todos los modelos a partir de nuestra secuencia problema:

     Creating Batch files for ProMod (if any):
             Batch.1: residues 30 - 137 of submitted sequence.
     
     Exiting AlignMaster
     
     
     ProModII trace log for Batch.1
     ============================================================
     
     ProModII: Loading Template: 11AYZ.pdb
     ProModII: Loading Template: 11UCZ.pdb
     ProModII: Loading Template: 12UCZ.pdb
     ProModII: Loading Raw Sequence
     ProModII: Iterative Template Fitting
     ProModII: Iterative Template Fitting
     ProModII: Generating Structural Alignment
     ProModII: Aligning Raw Sequence
     ProModII: Refining Raw Sequence Alignment
     ProModII: Weighting Backbones
     ProModII: Averaging Sidechains
     ProModII: Adding Missing Sidechains
     ProModII: Small Ligation (C-N < 3.0A) ignored;
     ProModII: GROMOS will repair it at residue ASP 73
     ProModII: Building CSP loop with anchor residues THR 60 and GLU 63
     ProModII:   Number of Ligations found:  (1)
     ProModII: all loops are bad; continuing CSP with larger segment
     ProModII: Building CSP loop with anchor residues PRO 59 and GLU 63
     ProModII:   Number of Ligations found:  (10)
     ProModII: ACCEPTING loop    5: clash=   1 FF=         53.8 PP=-18.41
     ProModII: Dumping Preliminary Model
     ProModII: Dumping Sequence Alignment
     ProModII: Done.

4. Como último paso, mediante el programa "Gromos96", se optimiza/an el/los modelo/os basándose en un proceso de minimización de energía. Este paso queda recogido de la forma:

     Gromos96 trace log for Batch.1
     ============================================================
     
     Now running PROCS1 on file batch-procs0.dat ... Done.
     Now running PROCS2 on file batch-procs1.dat ... Done.
     Now running PROGMT on file batch-procs2.dat ... Done.
     Now running PROGCH on file batch-procs2.dat ... Done.
     Now running PROMD on file batch-progch.dat ... Done.
     Now running PROMD on file batch-promd0.dat ... Done.
     Detection of SS-Bonds within batch ...

Recepción de un mail con las coordenadas 3D del modelo.

EJERCICIOS:

Ejercicio problema:

¿Por qué la siguiente enzima (un mutante hipotético) es inactiva?:

• Secuencia:
ANFQYIITEKKGKNSSVGLIQLNRPKALNALCNGLIEELNQALETFEEDP
AVGAIVLTGGEKAFAAGWDIKEMQNRTFQDCYSGKFLSHWDHITRIKKPV
IAAVNGYALGGGCELAMMCDIIYAGEKAQFGQPEILLGTIPGAGGTQRLT
RAVGKSLAMEMVLTGDRISAQDAKQAGLVSKIFPVETLVEEAIQCAEKIA
NNSKIIVAMAKESVNAAFEMTLTEGNKLEKKLFYSTFATDDRREGMSAFV
EKRKANFKDH
• Pasos recomendados a seguir:
1. Utilizar BLAST para conocer su secuencia original
2. Consultar SWISSPROT (y Pfam, InterPro, etc...) para conocer las características bioquímicas de la enzima.
3. Consultar la base de datos PDB para conocer la estructura de la enzima wild type.
4. Utilizar el servidor SwissModel para obtener un modelo del mutante.
5. Visualizar ambas estructuras para encontrar diferencias que expliquen su falta de actividad enzimática.
• Archivos de salida de SwissModel (Se recomienda no usarlos excepto en caso de que no se pueda conectar con SwissModel):
• Archivo de bienvenida: Swiss_Welcome.txt
• Tracelog: Swiss_Tracelog.txt
• Archivo de coordenadas PDB del molde: 1dub.pdb
• Archivo de coordenadas PDB deñ molde (sólo cadena E): 1DUBE_WT.pdb
• Archivo de coordenadas del modelo prpuesto para el mutante: 1DUBE_A98W.pdb

Otros Casos Propuestos (se recomienda usar el servidor SwissModel):

• HYPOTHETICAL 13.1 KD PROTEIN IN ILV6-CWH36 INTERGENIC REGION.
• Secuencia:

MWVPSMYPVKPPFISINLENFDMNTISSSLPIQEYIDSNGWIALPILHCWDPAAMNLIMV
VQELMSLLHEPPQDQAPSLPPKPNTQLQQEGEYSPTAPKAQVSTPKTAIASTSTTSTGI
• "pacC"; product: "DNA binding protein".
• Secuencia:

  MLGAMAEEAVAPVAVPTTQEQPTSQPAAAQVTTVTSPSVTATAAAATAAVASPQANGNAA
  SPVAPASSTSRPAEELTCMWQGCSEKLPTPESLYEHVCERHVGRKSTNNLNLTCQWGSCR
  TTTVKRDHITSHIRVHVPLKPHKCDFCGKAFKRPQDLKKHVKTHADDSVLVRSPEPGSRN
  PDMMFGGNGKGYAAAHYFEPALNPVPSQGYAHGPPQYYQAHHAPQPSNPSYGNVYYALNT
  GPEPHQASYESKKRGYDALNEFFGDLKRRQFDPNSYAAVGQRLLSLQNLSLPVLTAAPLP
  EYQAMPAPVAVASGPYGGGPHPAPAYHLPPMSNVRTKNDLINIDQFLQQMQDTIYENDDN
  VAAAGVAQPGAHYIHNGISYRTTHSPPTQLPSAHATTQTTAGPIISNTSAHSPSSSTPAL
  TPPSSAQSYTSGRSPISLPSAHRVSPPHESGSSMYPRLPSATDGMTSGYTAASSAAPPST
  LGGIFDNDERRRYTGGTLQRARPASRAASESMDLSSDDKESGERTPKQISASLIDPALHS
  GSPGEDDVTRTAKAATEVAERSDVQSEWVEKVRLIEYLRNYIANRLERGEFSDDSEQEQD
  QEQEQDQEQEQDQEQGQDRVSRSPVSKADVDMEGVERDSLPRSPRTVPIKTDGESAEDSV
  MYPTLRGLDEDGDSKMPS