Predicción de las características 1D a partir de la secuencia
 

Las características 1D de una secuencia son aquellas que pueden ser representadas por un solo valor asociado a cada aminoácido (B. Rost). Entre ellas incluiríamos los valores de características fisico-químicas de amino-ácidos, o las predicciones de estructura secundaria.

Las características 2D de las proteínas, por otro lado, corresponden a la descripción de los contactos entre los residuos de la proteína, ya sea a corta distancia o a larga distancia. Por contactos se entiende cualquier tipo de enlace (puente de hidrogeno, puente disulfuro), entre residuos. Los contáctos a corta distancia están relacionados con el tipo de estructura secundaria. Los contactos a larga distancia, sin embargo, dan información de la organización de los elementos de estructura secundaria. La prediccion de contactos, como herramienta para predecir la estructura terciaria es un campo poco desarrollado aún.

Las características 3D se refieren a la estructura terciaria de las proteínas.

Como consecuencia de los proyectos de secuenciación de genomas iniciados en los últimos años se ha incrementado el volumen de las bases de datos de secuencias (SWISS-PROT) aunque no así el de bases de datos de estructuras (PDB).

Actualmente no existen métodos capaces de a partir de su secuencia predecir la estructura 3D de una proteína. Sin embargo, si que se dispone de métodos capaces de predecir aspectos mas sencillos de su estructura, esto es, las características 1D, a partir de los cuales se puede derivar cierta información sobre su posible función y su estructura.
 

http://www.rcsb.org/pdb

H. influenzae

Se ha hipotetizado, y ha sido verificado para muchas proteínas, que la estructura 3D de una proteína (esto es su plegamiento) viene determinada únicamente por la especificidad de la secuencia. Por otro lado se sabe que las proteínas chaperonas juegan a menudo un papel fundamental en el plegamiento, y aun así se asume generalmente que la estructura final es la que representa el mínimo de energía libre. Es por esto que se afirma que toda la información sobre la estructura nativa de una proteína esta codificada en su secuencia amino acídica, aunque es especifica del medio en solución en que se encuentre. Sin embargo en la practica, la falta de precisión en determinación de los parámetros básicos de los que se derivaría la estructura 3D y los recursos informáticos limitados hacen que los métodos predicción mas fiables sean aquellos basados en el conocimiento, combinación de métodos estadísticos y empíricos. Sin embargo, como se ha demostrado en los experimentos de CASP (de los que os hablaran en próximas lecturas) no se puede aun predecir estructura a partir de secuencia.

Una simplificación del problema de predicción de estructura 3D es su proyección en cadenas de asignaciones estructurales. Por ejemplo, podemos asignar estados de estructura secundaria o solvatación para cada residuo identificándolos con un símbolo. De hecho, los mayores avances en bioinformática de la ultima década se han alcanzado en el campo de la de predicción de estructura secundaria. Estos avances se han alcanzado al combinar de algoritmos matemáticos complejos con la información evolutiva disponible en las bases de datos.
 
 

Las predicciones de características 1D, aunque locales e incluso a veces parcialmente correctas, son a menudo útiles para obtener información sobre la función de la proteína y/o los sitios activos y para llevar a cabo predicciones de mas complejas (aspectos estructurales de mayor dimensión).

Propiedades de los residuos

La información mas inmediata que podemos sacar de la secuencia de una proteína son características físico-químicas de sus residuos: hidrofobicidad, polaridad, etc.  Con esto podemos generar representaciones de, por ejemplo, como varía la hidrofobicidad a lo largo de la secuencia de la proteína para tener información como zonas muy hidrofóbicas, etc que puedan luego ayudarnos en la predicción de características estructurales.

Hay muchas herramientas que calculan este tipo de parámetros a partir de la secuencia. Muchas han sido dotadas de interfaces WWW que facilitan en gran medida su uso.

Este servidor toma como input una secuencia y permite elegir entre 54 parámetros.
Como output devuelve una representación gráfica de como varia ese parámetro a lo largo de la secuencia y un fichero con esos datos en forma numérica que otros programas pueden leer.

 Perfil de Hidrofobicidad Kyte-Doolitle

Accesibilidad

El objetivo es la predicción de la exposición de un residuo al solvente. La accesibilidad se puede describir de varias formas.

El método clásico asignaba uno de los valores "buried/exposed" en función de la hidrofobicidad del residuo. Con este método zonas muy hidrofóbicas son predecidas como "buried". El resultado de éste tipo de predicción se correlaciona, por tanto, con la predicción del perfil de Hidrofobicidad.

Sin embargo, métodos mas avanzados emplean análisis similares a los que se emplean en la predicción de estructura secundaria (que se comentan más adelante), como por ejemplo, el uso de redes neuronales u otros algoritmos que se entrenan con proteínas de estructura conocida, para las que se puede calcular la accesibilidad real de cada residuo al solvente.

Cuando la estructura de la proteína es conocida, la accesibilidad de cada residuo se calcula estimando el volumen expuesto al solvente de cada residuo embebido en una estructura (método desarrollado por Connolly y implementado posteriormente en DSSP). Una simplificación del mismo seria pasar de los valores normalizados (el valor observado dividido por el máximo valor posible) a una descripción con dos posibles estados "buried" (accesibilidad relativa < 16%) y "exposed" (accesibilidad relativa > 16%),tal y como se hacía con los métodos clásicos basados en hidrofobicidad.
 

Dickerson´s Dodecamer
Medida de la accesibilidad al solvente (Fig. from B. Rost).   La accesibilidad al solvente es normalmente medida haciendo rodar una molécula de agua esférica sobre la superficie de la proteína, el valor total es la suma de la superficie correspondiente a cada uno de los residuos (normalmente 0-300 Å2). Con objeto de comparar aminoácidos se calculan valores relativos (esto es el porcentaje de área accesible). Descripciones mas sencillas diferencian tan solo entre dos estados: buried (en la figura residuos 1-3 y 10-12) y exposed (residuos 4-9).

La accesibilidad para cada posición de la estructura 3D de la proteína es evolutivamente conservada dentro de cada familia de secuencias. Por lo tanto la información contenida en los alineamientos de secuencias se ha empleado para desarrollar de nuevos métodos de predicción, pasando de una fiabilidad del 75% al 79%.

Entre los servidores públicos para calcular la accesibilidad a partir de la secuencia de aminoácidos, se encuentran:

JPred2. JPred2 emplea perfiles de PsiBlast como input para sus redes neuronales y devuelve dos estados "buried/exposed". JPred2 es una versión avanzada de Jpred.

Estructura secundaria

La predicción de la estructura secundaria de una proteína, partiendo de su secuencia de aminoácidos, busca definir los segmentos que adoptan una de los tres "ESTADOS" de estructura secundaria: alfa hélice, beta (o conformación extendida) y loop (o coil).

La mayoría de los métodos usan redes neuronales u otros algoritmos que se entrenan con proteínas de estructura secundaria conocida para pasar luego a la predicción. Muchos de estos métodos usan información adicional proveniente, por ejemplo, de alineamientos múltiples.

La estructura secundaria de las proteínas usadas en la fase de "entrenamiento" (durante el desarrollo del programa) se asigna generalmente de forma automática, una vez se conoce la estructura terciaria de la proteína, en función de su perfil de puentes de hidrogeno entre los grupos carbonilos y NH del esqueleto o "backbone". El programa que más frecuentemente se usa para hacer esa asignación es DSSP.
 
 
 

 

Precedentes históricos de los métodos de predicción de estructura secundaria:

Una forma de introducir los métodos de predicción de estructura secundaria de proteínas es la cronológica (Eisenhaber, Persson and Argo, 1995) los describen sucintamente. Los hitos mas importantes que marcan el desarrollo de estos métodos de predicción se pueden resumir en cuatro principales: Otra forma de introducirlos, aunque obviamente relacionada con la histórica es la basada en las características del análisis empleado, así se dividen en:
Estos son métodos estadísticos basados en la tendencia que presentan los aminoácidos a adoptar estructuras secundarias.

El primero, propuesto por Chou y Fasman en 1974 empleaba estadísticas extrapoladas de las 15 estructuras de proteínas determinadas por rayos-X.

Tendencias que se basaban en las propiedades estereoquímicas y fisicoquímicas de los diferentes residuos (casos especiales son glicina y prolina). Este método se ha mejorado aumentando el número de proteínas empleadas.

El método presenta una fiabilidad de ~50% (cuando se emplean 62 proteínas para obtener las estadísticas).

La principal mejora de esta 2a generación de métodos es la combinación de bases de datos mayores de estructura de proteínas y el uso de estadísticas basadas en segmentos: típicamente 11-21 residuos adyacentes y las estadísticas se compilan para evaluar la propensión del residuo central de ese segmento a estar en una determinada estructura secundaria.

Los métodos de 1a y 2a generación presentaban problemas obvious:

Esto es consecuencia de:
La incorporación de la información evolutiva permite una mejora de estas predicciones. Los perfiles de intercambio de residuos extraídos de los alineamientos de una familia son indicativos de detalles estructurales específicos. Además estos perfiles implícitamente contienen información no local, ya que la selección evolutiva de proteínas se hace a nivel de estructura 3D y no a nivel de secuencia.

Los perfiles extendidos conseguidos a través de PsiBlast y Hidden-Markov-Models mejoran por tanto las predicciones.

Ventajas:

Problemas:

 
Kyte-Doolittle Hydropathy Scale

Scheme for PHD Protein Predictor Methods

Ejemplo de la salida de tres servidores de predicción de estructura secundaria. La secuencia pertenece a un dominio SH3. La estructura secundaria observada fue asignada con DSSP. Los niveles de fiabilidad de las predicciones son: C+F = 59%, GORIII = 65% y PHD = 72%. El "reliability index" presenta valores de 0-9. Para valores de Rel > 4 la predicción fue correcta.

Ejemplo de la fiabilidad (3-estados/residuo) de diferentes servidores de predicción de estructura secundaria.

Métodos de 1a generación: Chou & Fasman, Lim, GORI

Métodos de 2a generación: Schneider, ALB, GORIII

Métodos de 3a generación: LPAG, COMBINE, S83, NSSP, PHD

 

Los servidores públicos disponibles son:

Hélices Transmembrana

En el campo de la proteómica uno de los mayores retos es la determinación de la estructura de proteínas transmembrana, ya que son difíciles de cristalizar y son difícilmente analizables con NMR. Por lo tanto, la predicción de la estructura de este tipo de proteínas es de un mayor interés. Existen dos clases principales de proteínas de membrana : las que introducen hélices en la bicapa lipídica (Figura) y, proteínas que forman poros constituidos por barriles de betas (tipo porinas). Hasta el momento no existen servidores públicos para este segundo grupo debido a la falta de información experimental. La situación es muy diferente para las hélice transmembrana. La estructura 3D se puede determinar conociendo la precisa localización de las hélices transmembrana explorando simplemente todas las conformaciones posibles.
 


 
Hélices de membrana (Fig. from B. Rost).   Para cierta clase de proteínas de membrana, típicamente los segmentos apolares de la hélice se encuentran embebidos en la bicapa lipídica orientados de forma perpendicular a la superficie de la membrana. Las hélices pueden ser consideradas como cilindros rígidos. La orientación de las hélices con respecto a la célula puede ser definida por la orientación del primer residuo N-terminal. La topología es definida como fuera cuando el N-terminal esta en la región extra-citoplasmática (proteína A), y como dentro si el N-terminal empieza en la región intra-citoplasmática (proteínas B y C). La parte inferior explica la regla de  'inside-out-rule'. 

A pesar de la dificultad de para su determinación experimental, estas proteínas presentan fuertes restricciones estructurales ya que la bicapa lipídica reduce los grados de libertad. Las hélices transmembrana se pueden predecir a partir de observaciones que limitan el problema: (a) estas hélices son predominantemente apolares y con una longitud de 12-35 residuos, (b) las regiones globulares entre hélices presentan típicamente longitudes menores de 60 residuos, (c) la mayoría de las hélices transmembrana tienen una distribución característica de los aminoácidos positivos arginina y lisina (definida en la regla 'positive-inside-rule' by Gunnar von Heijne) de forma que los "loops" en la zona interior de la membrana tienen mas cargas positivas que los "loops" en la zona exterior de la misma, (d) las regiones globulares largas (> 60 residuos) difieren en su composición de aquellas sujetas a la regla 'positive-inside-rule'.

La mayoría de los métodos se basan en redes neuronales u otros algoritmos que se entrenan con proteínas de estructura conocida. Se consiguen mayores porcentajes de acierto ya que estas hélices suelen tener patrones muy claros (anfipaticidad, etc) que son rápidamente asimilados por los algoritmos de aprendizaje. La mayoría de los métodos compilan esta información de hidrofobicidad, y los mas avanzados incluyen la regla " positive-inside-rule" para predecir además la orientación en la membrana.La inclusión de información evolutiva mejora considerablemente las predicciones de hélices transmembrana, aunque esto se compensa de alguna forma con el crecimiento de las bases de datos de secuencias.

Los servidores públicos disponibles (listado):

La correcta evaluación de los métodos de predicción de hélices transmembrana es difícil como consecuencia de: (a) la falta de estructuras de alta resolución que nos permitan llevar a cabo análisis estadísticos significativos, (b) los experimentos de baja resolución no proporcionan la misma calidad de información, por lo tanto no son útiles para evaluar la fiabilidad, (c) debido a la falta de datos experimentales los métodos de predicción funcionan mejor para las proteínas que se emplearon para su desarrollo.
La fiabilidad de los mejores métodos (HMMTOP2, PHDhtm, y TMHMM2) predicen correctamente todas la hélices para un 70% de las proteínas estudiadas y prediciendo además en un 60% de los casos la correcta topología. La mayor fiabilidad por residuo la alcanza PHDhtm con un 70%. En general todos los métodos tienden a subestimar las predicciones en un ~86% y a confundir péptido-señal con hélices transmembrana. Además, la mayoría de los métodos, sobre todo aquellos basados solamente en escalas de hidrofobicidad, sobre-estiman las predicciones de hélices de membrana en casos de proteínas globulares en un 90%. El error de las predicciones se calcula entre un 25% para PHDhtm y un 34% para TMHMM2.  Sin embargo, esto se puede contrarrestar ya que los métodos de predicción de péptidos señales son bastante fiables y la mayoría de las hélices transmembrana incorrectamente predecidas empiezan antes del décimo residuo del extremo N-terminal metionina y por lo tanto pueden ser corregidas por expertos. A pesar de los problemas de sobre-estimación, estas predicciones son útiles para buscar proteínas de membrana en genomas completos, además la mayoría no se basa exclusivamente en los valores de hidrofobocidad.
 
 

Hélices Transmembrana (Perfil TMHMM)
 

Predicción de Péptidos de Señal (SignalP)

El servidor SignalP predice la presencia y localización de sitios de ruptura de péptidos señal en secuencias proteicas de diferentes organismos.

Dado que las características de los péptidos señales están relativamente bien conservadas y bién caracterizadas, es posible hacer predicciones con alta fiabilidad.

En las siguientes se muestran, respectivamente, las características generales de los péptidos señales en Eucariotas y en Procarioras Gram(+) y Gram(-), la distribución de longitudes de péptido señal en esos tres grupos de organismos, y un ejemplo de la salida de SignalP.
 
 


 
 


 


 

Modificaciones Post-transcripcionales

El servidor ExPASy Proteomics tools incluye una serie de herramientas para predecir características 1D.

Evaluación automática de los servidores de predicción: EVA

EVA es un sistema para la evaluación automática de servidores de predicción de varios tipos:
 

En la figura siguiente se observa una comparación tpica de la precisión en la predicción de estructura secundaria de varios servidores.
 
 


 


 

Predicción de la función de proteínas a partir de características 1D

Como ya se ha adelantado más arriba, las características 1D de proteínas, además de proporcionar información que puede ser útil para predecir la estructura erciaria de proteínas, pueden ser muy útiles para predecir la funci'on de una proteína.

Un ejemplo muy obvio sería la detección de motivos característicos de un determinado tipo de enzima.

ProtFun es un servidor que, utilizando información muy elemental, que en principio no depende de la existencia de similaridades significativas en las bases de datos, predice función a un nivel básico. Para ello, calcula unos 20 parámetros de la proteína y usa una red neuronal entrenada con información sobre proteínas de funcion conocida.
 


 
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