Uso de Motivos en Analisis de Secuencias

Práctica de Análisis de Secuencias

Luis Sánchez (PDG - Centro Nacional de Biotecnología)

Paso 1 Extraccion de la Secuencia de algun Gen DOF de Arabidopsis con SRS

Abrir SRS (en EBI) y cliquear en START para empezar la sesion.
Seleccionar la Base de Datos SWALL(SPTR) y vamos a la forma "Extended" (en Query forms)
Escribir dof en AllText y en Organismo ponemos Arabidopsis y A Buscar(Submit Query).
Cliquear en cualquiera de las 18 entradas resultantes (Entrada ejemplo)
Grabar esta secuencia como Texto

Si echais un vistazo a las anotaciones presentes en SRS para esas once secuencias, podemos hacernos una idea de con que proteinas estamos tratando, Keywords: Zinc Fingers - Transcription Factors

Paso 2 Busquedas Blast con Dof

Conectar con la Pagina Web de Busquedas Blast (en EMBL )
Echarle un vistazo a la pagina y a las diferentes ayudas.
Introducir la Secuencia proteica de Dof en el campo de texto
Seleccionar la base de datos nrdb
Cambiar el numero de Descripciones y Alinemientos : Ponerlo a 100
Podriais enviar la Busqueda cliqueando al Botoncito Submit Query , pero para no saturar el servidor y para ahorrar tiempo, los resutados estan Aqui
Analisis de Resultados.

Echadle un vistazo a las secuencias encontradas (estan lincadas a SRS) y a los diferentes campos de los resultados blast.

En este caso el grafico de rallitas es muy informativo, que significa?.

La secuencia Query ha sido filtrada (algunas residuos han sido sustituidos por X automaticamente), por que?

Cliquear en Get the selected sequences para cojer las secuencias homologas a Dof.

Grabar estas secuencias como Texto (Por si hay algun problema en la conexion, Podeis Tomar las secuencias Aqui

Paso 3 Alineamiento de las Proteinas Dof con ClustalW

Abrir el servidor ClustalW (en EBI)

Echarle un vistazo a las diferentes Ayudas y Parametros .

Introducir las Secuencias Dof obtenidas del blast anterior.

(Mejor cliquear a Browse)

De igual forma que antes, podriamos Cliquear en RUN CLUSTALW, pero para no saturar el servidor del ClustalW, podemos ver los resultados Aqui
Analisis del Alineamiento

Que podemos decir de las Proteinas Dof?

Se podia prever este resultado a partir de los Resultados Blast? (la pista es el campo de rallitas).

Visualizar los alineamientos con buenos programas, nos facilitara el analisis. Un par de ejemplos de Visores de Alineamientos son:

Con lo visto hasta ahora, hemos encontrado todos los homologos claros a la proteina Dof con la que empezamos la busqueda.
Tambien hemos definido una region conservada dentro de la familia. Pero nos queda por Responder la Pregunta de:
Existen otras familias de proteinas lejanamente relacionadas con Dof?

Paso 4 Analisis de la Secuencia Dof con Prosite

Abrir el servidor Prosite (en ISREC)
Seleccionad Prosite profiles (NScore) y Prosite patterns (no score)
Introducir una de las Secuencias Dof en el campo de texto
Cliquear en Run ProfileScan
Analisis de Resultados

Veis algo en claro?

Paso 5 Analisis Pfam de la Secuencia Dof (hidden Markov models)

Abrir el servidor de Pfam (en Sanger Center)

Echadle un vistazo a las Diferentes formas de buscar en esta base de datos de Alineamientos.

Cliquear en PROTEIN SEARCH.
Introducir la Secuencia Dof correspondiente a la zona conservada en la familia, en el campo de texto mayor.

Por ejemplo:

QEQLKCPRCDSPNTKFCYYNNYNLSQPRHFCKSCRRY
WTKGGALRNVPVGGGSRKNATKRSTSSSSSAS

Cambiar E-value cutoff level: a un valor de 100

Esto hara que la busqueda sea mas permisiva.

Al igual que antes, podriamos Cliquear en Search Pfam, pero para no saturar el servidor y ahorrar tiempo, podemos ver los resultados Aqui
Analisis de los Resultados Pfam

Que podemos decir de las Familias que aparecen en la busqueda Pfam?

Cliquear en los Dominios mas Interesantes(Son Factores de Transcripcion):

TFIIS
GATA

Campos Pfam

Enlaces a PROSITE (el SRS-UK suele ser mas rapido)
Alineamientos (Mejor seleccionar el completo - Full)
Organizacion de Dominios (Mejor seleccionar el semilla - seed)

Que podemos decir de la organizacion de Dominios de la familia GATA?

Echadle tambien un vistazo a la distribucion en Especies - Species Distribution

Tan solo con los resultados obtenidos de Pfam, nos resultaria imposible discernir a cual de los dos factores de transcripcion se parece nuestra familia Dof (GATA o TFIIS). Pero si la Prediccion de Estructura Secundaria (PHD) de Dof nos diese el siguiente Resultado:

AA         LKCPRCDSPNTKFCYYNNYNLSQPRHFCKSCRRYWTKGGALRNVPVGGGSRKN..ATKRSTSS
PHD_sec                EEEE        HHHHHHHHHEE    EEEE                    
Rel_sec    999999999995476449999997134423443114799465637999997699999998999
SUB_sec    LLLLLLLLLLLL.EE..LLLLLLL............LLL.EEE.LLLLLLLLLLLLLLLLLLL

Con cual de las dos familias relacionariais a Dof???
(Las estructuras secundarias de GATA y TFIIS las podeis ver en los alineamientos completos suministrados por Pfam)

Espero que llegueis a conclusiones parecidas a las que llego esta gente: Shimofurutani N, Kisu Y, Suzuki M and Esaka M

Y para terminar, un vistazo a la estructura de GATA.
Fijaos en como las diferentes Cys coordinan el Zinc.

Otras Figuras son:

Clustalw & Phylodendron

Podeis probar con este alineamiento

[CNB] [Protein Design Group][- Curso -]