Práctica Eucariotas: gen humano
Vamos a analizar con diferentes herramientas de predicción de genes una secuencia del genoma humano. Intentaremos identificar los exones y los intrones, deducir la ORF del mRNA maduro, predecir si hay una región promotora en la secuencia y decidiremos de entre todas las estructuras génicas propuestas por las diferentes aplicaciones, cual nos parece mejor.
Secuencia: 
>human
AGCTTTCTTCTTTTCCCTGTTGCTCAAATAAATAGTGTTCTTTGCTCAAA 
CCCCCTTTCCCTCCTCCTTCTGCAATCTCAGCGCCTAGCGAAATCTGTTT
TCTTCATTGTAACCTCAGCTTCACCGCAATTAATTTTTTTTCCCTCTGGT 
CACAAGATAATTCCTGACGCCAGTGAGTCTGGAGGTCAGACGAACAGCAA 
ATTGGGGAACAAGGCGGCACTAATTCCTTACAAGTTCCTTGAAAAATCTT 
TCGCTTAAAAAAAACGGGGGGTGGGGGGAGCTTCTTTGCTGTTCAGGGAT 
TTATGCCTCGCGGAGCTGTGGCTCGAACCAGTGTTGGCTAAGGCGGACTG 
GCAGGGGCAGGGAAGCTCAAAGATCTGGGGTGCTGCCAGGAAAAAGCAAA 
TTCTGGAAGTTAATGGTTTTGAGTGATTTTTAAATCCTTGCTGGCGGAGA 
GGCCCGCCTCTCCCCGGTATCAGCGCTTCCTCATTCTTTGAATCCGCGGC 
TCCGCGGTCTTCGGCGTCAGACCAGCCGGAGGAAGCCTGTTTGCAATTTA 
AGCGGGCTGTGAACGCCCAGGGCCGGCGGGGGCAGGGCCGAGGCGGGCCA 
TTTTGAATAAAGAGGCGTGCCTTCCAGGCAGGCTCTATAAGTGACCGCCG 
CGGCGAGCGTGCGCGCGTTGCAGGTCACTGTAGCGGACTTCTTTTGGTTT 
TCTTTCTCTTTGGGGCACCTCTGGACTCACTCCCCAGCATGAAGGCGCTG 
AGCCCGGTGCGCGGCTGCTACGAGGCGGTGTGCTGCCTGTCGGAACGCAG 
TCTGGCCATCGCCCGGGGCCGAGGGAAGGGCCCGGCAGCTGAGGAGCCGC 
TGAGCTTGCTGGACGACATGAACCACTGCTACTCCCGCCTGCGGGAACTG 
GTACCCGGAGTCCCGAGAGGCACTCAGCTTAGCCAGGTGGAAATCCTACA 
GCGCGTCATCGACTACATTCTCGACCTGCAGGTAGTCCTGGCCGAGCCAG 
CCCCTGGACCCCCTGATGGCCCCCACCTTCCCATCCAGGTAAGCCTCGAA 
GTCGGGACAGGGCTGAACACCCAGGCAAGGATGCTGCGGGACCCTCGGAG 
CTCCCGATTGCCTCGCGTAACTCTTCCCTCTTTTCCTCTAATCAGACAGC 
CGAGCTCGCTCCGGAACTTGTCATCTCCAACGACAAAAGGAGCTTTTGCC 
ACTGACTCGGCCGTGTCCTGACACCTCCAGGTGAGTATCTCCTCTCTTGG 
AGAGGGAGGTTTAAACGGCAAGTCCTGGAGTTGGCAGACGTTTTGAAAAA 
TTGCCACTCACTCGGTTTAGGGAAACTGAGGCCAGAGAGGGACAAGTGAC 
TTGCCCATGGTTGCATCAAATGAATGGCAGAGTCAGTTTCCATGTGATGT 
GCATTTAAGCCTTAATGCGCCTGGCCCTGCCTCCGCAGTGGCCGAGGTCT 
GGCAAGTAGACATGGTCCGACTAAATACAAGTCTTTCTGTTCCATGTTGT 
ATAGGAGCTGTCTTCGGCAGCCCCCTCCCAGCTAGTGTCAATTCCAAGTA 
GGAGGGGTAGCGCAACGTCCGCCTGTGGTCTTTGGCGCCAACTGGGTGGG 
GGCAGCGTGGGGGGCGGAGTTATCAGGCTGGAGGTACAGACCAAGTTTCC 
TCCCTGGCGCCGGCCAGTCTGCGGACGGCCCCCGCCTCGGCACGCTCGGC 
GGAAACTGACTGCTCCTTGGTCTTCTTTCCTCCCCCGCCCAGAACGCAGG 
TGCTGGCGCCCGTTCTGCCTGGGACCCCGGGAACCTCTCCTGCCGGAAGC 
CGGACGGCAGGGATGGGCCCCAACTTCGCCCTGCCCACTTGACTTCACCA 
AATCCCTTCCTGGAGACTAAACCTGGTGCTCAGGAGCGAAGGACTGTGAA 
CTTGTGGCCTGAAGAGCCAGAGCTAGCTCTGGCCACCAGCTGGGCGACGT 
CACCCTGCTCCCACCCCACCCCCAAGTTCTAAGGTCTTTTCAGAGCGTGG 
AGGTGTGGAAGGAGTGGCTGCTCTCCAAACTATGCCAAGGCGGCGGCAGA 
GCTGGTCTTCTGGTCTCCTTGGAGAAAGGTTCTGTTGCCCTGATTTATGA 
ACTCTATAATAGAGTATATAGGTTTTGTACCTTTTTTACAGGAAGGTGAC 
TTTCTGTAACAATGCGATGTATATTAAACTTTTTATAAAAGTTAACATTT 
TGCATAATAAACGATTTTTAAACACTTGTGTATATGATGACACCCGTCTC 
CATTAAGTACTAATGATGCTTTCTCGCACATGGCCGAATTTTGGGAGCTT 
TGGGAAAGTGAACTTGCTTATTCTACGAGAGGGAAATGAAAAACTGCCTG 
GTTGAGAGGGGATGGGGTGGAGAGAGAAGGGTTCATGATGGGAGTCTCAT 
GTCCATTGAGGGATGGGTGCAGAGAAAAGTTCTGGCTCTGCCTCATTATT 
TCAGAGATGAAACCAGAGACTGGTGCAAGCT
Pasos:
Existen muchos servidores en los que correr aplicaciones para identificar y modelar genes. Cada uno de ellos basa la búsqueda en propiedades o algoritmos diferentes generando en ocasiones resultados distintos. En general es conveniente consultar a varios de ellos para tener una idea clara de la estructura génica de la secuencia.
  1. Veamos si hay evidencias de transcripción de algún fragmento de nuestra secuencia. Para ello usaremos la herramienta BLAST contra una base de datos de EST (Expresed Sequence Tag). En esta búsqueda nos interesará el mejor alineamiento global posible de la secuencia de EST con nuestra secuencia del gen. Lo ideal es encontrar un EST que alinee en toda su longitud con nuestro gen con un e-value muy bajo.

    2. - Entramos en la pagina web del BLAST del NCBI y hacemos click en "Standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn]
    - Copiamos nuestra secuencia y la pegamos en la caja de "Search"
    - Elegimos la base de datos de "est" en el apartado "Choose database". Como es una secuencia humana, elegimos la de ESTs de humanos
    - El resto se deja como está y pulsamos "BLAST!"
    Después de un rato debería salir un resultado semejante a éste. 

    ¿Qué significan, en el gráfico, las líneas negras discontinuas que vemos entre las lineas rojas?
    ¿Existe alguna información ambigua o contradictoria?
    ¿Qué podemos deducir de este resultado?
    Sería conveniente ir haciendo un esquema en una hoja de papel, en forma de mapa lineal, y representar los datos que vamos obteniendo.
    ¿Sería suficiente con este resultado para conocer la estructura génica de nuestra secuencia?
     

    Aunque podemos empezar a construir un modelo del gen a partir de los resultados de BLAST contra ESTs: primero, existen ciertos datos contradictorios y, segundo, no tenemos información sobre las fases abiertas de lectura. Por tanto, vamos a usar una serie de servidores de predicción para intentar confirmar el modelo que tenemos de momento, y para predecir codones de inicio y terminación y regiones promotoras.
     
  1. Intentemos identificar en la secuencia algún posible codon de iniciación.

    2. Abrimos, en un nueva ventana, el servidor AUG evaluator.
    A continuación elegimos la especie, insertamos la secuencia en el campo correspondiente y presionamos "Submit" (resultado).
    Identificar los codones de iniciación predichos con una puntuación más alta.
    ¿Alguno concuerda con los datos que tenemos hasta ahora?
  1. Ahora vamos a usar varios servidores de predicción de exones e intrones para identificar la fase abierta de lectura y validar nuestro modelo. Esto es especialmente importante a la luz de los resultados ambiguos obtenidos en el análisis con BLAST.


    2. ¿Hay diferencias entre los resultados de los distintos programas?
    ¿Podemos validar el modelo propuesto a partir de los resultados de BLAST?
     
  1. Ahora vamos a repetir el proceso en un Metaserver. Los metaservers son servidores que lanzan a su vez procesos en otros servidores de aplicaciones. Algunos, simplemente, devuelven los resultados de todos los servidores que han sido consultados y en otros integran las respuestas de forma más o menos inteligente.

    2. Nos conectamos a METAGENE, abriendo una nueva ventana.
     
    • Escribimos nuestro correo electrónico en el campo correspondiente. No es obligatorio pero si conveniente
    • Insertamos la secuencia en "Sequence"
    • Pasamos a "Sequence analysis options":

      • - Orientation y Features: todo seleccionado
      - Engine Select; seleccionamos los servidores disponibles: GenScan, Ebest y Grail.
      - En Ebest: Human y Both seleccionados
      - GeneScan: Vertebrate seleccionado
      - Grail: Human seleccionado
    • Submit

      •  
    Para ver los resultados hacemos click en el enlace "Current Search Results". Esto nos llevará a una página donde tendremos la oportunidad de ver el resultado de cada servidor en detalle. Lo más conveniente es apretar donde pone "click here to annotate the results" Esto nos abre una ventana donde compara los resultado de todos los servidores (resultado). En el menu pinchamos en "Tools" y seleccionamos "Analysis" (resultado).
    Aparece un histograma que permite valorar la validez de la predicción consenso que genera el Metaserver.
    Fijarse en los resultados de Ebest.

    Nota: GeneBuilder también es una herramienta muy completa de análisis. No consulta a varios predictores de genes pero si busca ESTs y tiene un entorno gráfico con mucha información. Es sencillo e intuitivo. Sería recomendable probarlo con este ejemplo en algún momento libre.
  1. Acabando: ¿Se puede detectar alguna isla GpC que coincida con el principio del gen?

    2. Para ello, analiza la secuencia genómica con CPGplot.

Manuel José Gómez Rodriguez y Ramón A-Allende