Localización y enmascaramiento de secuencias repetidas. Métodos de comparación (métodos Extrínsecos o Comparative methods). Análisis de la secuencia de DNA a nivel de nucleótido (Content-based methods). Análisis de señales o motivos (Signal-based methods). Busqueda en bases de datos de secuencias expresadas.
Especialmente en el caso de genomas eucariotas, la primera fase del proceso de predicción de genes es localizar zonas de secuencias repetidas, en las que es poco probable encontrar elementos reguladores y secuencias codificantes. Las zonas de secuencias repetidas pueden ser entonces descartadas a la hora de ejecutar otros tipos de análisis, o enmascaradas, mediante la sustitución de los caracteres que representan los cuatro nucleótidos por otro símbolo arbitrario, por ejemplo "N" o "X".Además de servir para descartar regiones de menor interés desde el punto de vista funcional, el enmascaramiento de secuencias repetidas facilita la búsqueda de secuencias similares en bases de datos de secuencias con, por ejemplo, programas de la familia de aplicaciones BLAST.
Normalmente, el enmascaramiento es realizado de forma automática por muchos programas. En BLASTN, por ejemplo, el usuario puede seleccionar distintos tipos de filtro, aunque la opción por defecto enmascara las denominadas regiones de baja complejidad mediante un programa llamado DUST. Otras opciones en BLASTN permiten enmascarar secuencias repetidas humanas (LINEs y SINEs) o secuencias especificadas por el usuario, mediante el uso de minúsculas, en la secuencia usada como "query".
Uno de los programas más usados para enmascarar secuencias repetidas en secuencias de mamíferos es RepeatMasker, que filtra tanto regiones de baja complejidad, como aquellas secuencias identificadas por su similaridad a las de una base de datos de secuencias repetidas, RepBase, mantenida por el Genetic Information Research Institute (GIRI). En promedio, el 50% de cualquier secuencia genómica humana sería reconocido como secuencias repetidas, y enmascarado, por RepeatMasker. Un ejemplo de la salida de RepeatMasker puede verse aquí.
La búsqueda de genes o de productos génicos homólogos es uno de los métodos más antiguos y más usados para identificar secuencias codificantes y determinar la estructura de genes. Este tipo de métodos se califican como extrínsecos porque se basan en usar información procedente del estudio de otros genomas. Son, por tanto, menos eficientes en Eucariotas que en Procariotas dada la menor abundancia de información de especies evolutivamente cercanas.La familia de aplicaciones BLAST incluye programas que permiten hacer diferentes tipos de búsquedas.
Si se conoce, o se puede predecir, la secuencia del producto genico, o parte de ella, otros programas permiten usar la secuencia de aminoacidos como "query":
- BLASTN permitiria identificar genes parecidos en bases de datos de secuencias de DNA, usando la secuencia genomica como "query".
- BLASTX traduce la secuencia "query" en las seis fases de lectura posibles y hace busquedas en bases de datos de proteinas; esto permitiria identificar productos genicos parecidos a los codificados por la secuencia genomica, y serviria para identificar regiones codificantes (no intrones).
- TBLASTX traduce la secuencia "query" en las seis fases abiertas de lectura y hace busquedas en bases de datos de secuencias de DNA tambien traducidas en la seis fases de lectura posibles; esto serviria para identificar secuencias que codifican para productos parecidos a los que codifica la secuencia "query".
El programa Procrustes está diseñado para intentar deducir la estructura de un gen, en cuanto a intrones y exones, basándose en la secuencia de aminoácidos de una serie de proteínas homólogas a las que supone está codificada por el fragmento de DNA que se está analizando. La secuencia de dichas proteínas homólogas tiene que ser facilitada por el usuario del programa, que podría haberlas identificado mediante búsquedas con BLASTX, por ejemplo. Si la secuencia aminoacídica facilitada es la que codifica el fragmento de DNA, Procrustes es capaz de reconstruir la estructura del gen con un 99% de exactitud.
- BLASTP busca proteinas parecidas en bases de datos de proteinas.
- TBLASTN hace busquedas en bases de datos de secuencias de DNA traducidas en la seis fases de lectura posible.
La figura de abajo es un ejemplo de resultado obtenido con Procrustes, en el que proteinas homólogas de varios organismos han sido alineadas con una secuencia genómica de DNA, para predecir la organización de intrones y exones.
El grado de conservación de cualquiera de esos motivos varía considerablemente. Aquellos relativamente conservados pueden ser identificados mediante búsquedas con secuencias consenso, que representan la secuencia del motivo para una cierta mayoría de ejemplos. Fuzznuc es un ejemplo de programa para buscar ocurrencias de una secuencia consenso en otra secuencia. El programa permite especificar el número de fallos (mismatches) que serían aceptables, así como utilizar secuencias consenso ambiguas (por ejemplo, [ACG] significa A, C o G).
Las secuencias consenso (incluso las ambiguas) tienen el problema de que no contienen información de la frecuencia con que cada nucleótido ocurre en cada posición. Dicha información puede ser expresada, sin embargo, en forma de perfiles (profiles o position weight matrices, PWMs), que son tablas en las que se recoje la frecuencia con que cada nucleótido aparece en cada posición a lo largo de la secuencia.
Una aproximación parecida es la de los algoritmos que usan
modelos
ocultos de Markov (Hidden Markov Models, HMM).
Muchos de los programas desarrollados recientemente para detectar los límites
entre exones e intrones (ver sección
3) usan esta estrategia.
Estos métodos hacen uso de información proviniente de técnicas experimentales diseñadas para identificar productos génicos de forma masiva. Ejemplos representativos de esta estrategia son el uso de bases de datos de ESTs, de cDNAs completos y de secuencias N-terminales de proteínas, que son utilizados para confirmar la existencia de genes y para deducir la estructura genica.
Los ESTs (Expressed Sequence Tags) son secuencias cortas de DNA (de 200 a 500 pb), generadas mediante la secuenciación de los extremos 5' y 3' de clones de cDNA seleccionados al azar. Los clones de cDNA se obtienen, a su vez, por transcripción reversa de RNA mensajero, usando un oligo(dT) como primer, normalmente, lo que asegura que al menos la secuencia del extremo 3' del RNA está incluida en el cDNA. Aunque los cDNA así obtenidos suelen corresponder con fragmentos de RNA mensajeros, la secuenciación de los extremos de los clones permite la identificación, de una manera rápida, del repertorio de genes expresados en una cierta condición, por un cierto tipo de células.
Dado que las genotecas de cDNA se obtienen a partir de RNA mensajero que ha sido ya procesado (maduro), los ESTs consisten en secuencias exónicas. Dependiendo del grado de degradación del RNA original, de la eficacia de la Transcriptasa Reversa y de la organización y la longitud de cada gen, las secuencias de los ESTs pueden corresponder a otros exones además de al terminal.Por tanto, la identificación de ESTs que corresponden con fragmentos de una secuencia de DNA genómico, primero, sirve para detectar la presencia de un gen; y segundo, puede servir para deducir la organización de sus exones e intrones.
La principal base de datos pública sobre ESTs es dbEST, que es mantenida por el NCBI y que es, de hecho, una de las divisiones de la base de datos GenBank. La base de datos incluye un inventario que se atualiza periódicamente y en el que se desglosa la composición de las entradas por organismos. El 31 de Mayo de 2002 había unas más de 11.800.000 entradas, de las cuales 4,458,865 correspondían a ESTs humanos y 2,590,400 a ESTs de ratón. La base de datos aumenta muy rápidamente. Las entradas de la base de datos pueden ser recuperadas mediante búsquedas con palabras clave, desde la página principal de dbEST. A la hora de desarrollar el modelo de un gen, una secuencia genómica se puede usar como "query" en búsquedas con BLASTN restringidas a la base de datos de ESTs. El EBI mantiene una página con enlaces a sitios web relacionados con ESTs (EST Links).
Hay que tener en cuenta que el uso de los ESTs para detectar o modelar genes tiene las siguientes limitaciones:
- Como ya se ha mencionado, suelen representar sólo el extremo 3' del gen.
- Son secuencias de regular calidad, que pueden tener errores (hasta el 3%, frente al 0.01% de secuencias genómicas humanas; Collins et al 1998).
- Pueden corresponder a secuencias intrónicas si la librería de cDNA estaba contaminada con DNA genómico (Wolfsberg and Landsman, 1977)
- Esta última posibilidad no es distinguible de los casos de splicing alternativo, que se presume ocurre en un 35% de los genes humanos (Mironov et al 1999).
cDNAs completos: dbEST almacena no sólo secuencias de ESTs, sino secuencias de cDNA completos, cuyas secuencias pueden corresponder a la práctica totalidad de los ARNm maduros que sirvieron de molde. Las secuencias de cDNA completos pueden provenir de grupos experimentales que han caracterizado genes individualmente. Sin embargo, existen también una serie de proyectos a nivel mundial cuyos esfuerzos están orientados a obtener sistemáticamente la secuencia completa de todas las especies de RNA producidas por un organismo dado, mediante la secuenciación completa de genotecas de cDNA. La catalogación de todos los RNAs producidos por un organismo (o un tejido, o un tipo celular), junto con los datos de expresión obtenidos en experimentos de gran escala con DNA arrays, contribuirán a definir los TRANSCRIPTOMAS de cada organismo.
A continuación se presenta una lista con enlaces a las páginas web de algunos proyectos de secuenciación de cDNAs.
- The Mammalian Gene Collection: secuenciación de cDNAs humanos y de ratón.
- HUNT (human novel transcripts): secuenciación de cDNAs humanos y desarrollo.
- The German Human cDNA Project: secuenciación de cDNAs humanos específicos de tejidos o de cromosomas.
Por supuesto, la disponibilidad de secuencias completas de cDNA simplifica enormemente el problema de mapear sobre el genoma la posición de los intrones y exones de un gen. El alineamiento de un cDNA con su correspondiente secuencia genómica sirve para identificar, de forma casi automática, la localización de los exones y los intrones. Como ejemplo, la figura de abajo muestra un esquema del alineamiento de un cDNA (GenBank Acc AL541035) con su correspondiente secuencia genómica, realizado con el programa SIM4 y visualizado con LalnView. El gen tiene tres exones, cuyas secuencias son mas de un 90% similares a las correspondientes secuencias genómicas, y dos intrones. La cola poli A del extremo 3' del cDNA, obviamente, no tiene correspondencia en la secuencia genómica.
Por último, igual que la identificación de ESTs o cDNAs que corresponden a una secuencia genómica es indicativo de la existencia de un gen funcional, la identificación de proteinas cuya expresión ha sido verificada experimentalmente y cuya secuencia está codificada por una secuencia genómica, también demuestra la presencia de un gen que se expresa.
En este sentido, las iniciativas para caracterizar el repertorio de proteinas expresadas por un organismo, o PROTEOMA, ayudarán a identificar nuevos genes o a confirmar su predicción. Si la secuencia del extremo N terminal ha sido obtenida experimentalmente, dicha información permite deducir el codon de iniciación de la fase abierta de lectura.Como ejemplo, la identificacion de genes por búsqueda en un base de datos de secuencias N-terminales de proteinas fue utilizada para anotar el genoma de Escherichia coli [Science 277:1453 (1999)]. Una lista de proteinas de Escherichia coli cuyo extremo amino ha sido confirmado experimentalmente, por secuenciación del extremo amino terminal, puede encontrarse en EcoGene. La lista incluye 850 proteínas de las cuales se puede obtener bibliografía e información adicional, mediante enlaces a otras bases de datos.
Computational Gene Identification. R.Guigó. Curso de Doctorado en Bioinformática. UAM 2001. Computational Gene Finding. R. Guigó et al. Course 2001. Finding genes. Conceptos básicos sobre el uso de HMM para identificar genes. Protein and DNA Hidden Markov Models. User's guide for HMMer. Sean Eddy. Washington University. Predictive methods using DNA sequences. A. D. Baxevanis. En "Bioinformatics. A practical guide to the analysis of genes and proteins". Wiley-Interscience, New York 2001. Predictive methods using nucleotide sequences. J. W. Fickett. En "Bioinformatics. A practical guide to the analysis of genes and proteins". Wiley-Interscience, New York 1998. Gene prediction tools. L. Milanesi e I. B. Rogozin. En "Protein sequence analysis in the postgenomic era". CLUEB, Bologna 2001. Recent developments and future directions in computational genomics. S. Tsoka and C. A. Ouzonis. FEBS Letters 2000, 480:42. Untranslated regions of mRNAs. F. Mignone et al. Genome Biology 2002, 3(3):reviews0004.1. Páginas web de los distintos programas mencionados en, y enlazados desde, esta misma página y desde esta otra.
